优配网植入级可吸收聚氨酯用于精确涂抹生物粘合剂以预防医源性早产胎膜早破的微创手术器械_胎儿_密封_羊膜

引言：内镜下胎儿手术的益处因医源性早产胎膜早破（iPPROM）的高风险而大打折扣。尽管先前的研究已经报道了一些有望用于预防胎膜破裂的良好密封材料优配网，但将这些材料输送到胎膜穿刺部位的问题仍未解决。

材料与方法：我们描述了一种通过胎儿镜端口将密封材料涂抹到羊膜上的方法。我们开发了一种由伞状聚酯涂层镍钛合金网和一个涂抹器组成的器械。自动展开的伞被推过端口，拉至紧贴羊膜，并粘贴在羊膜缺损部位。我们测试了多种粘合剂的粘附强度，并在一个离体模型中测试了这种胎膜密封方法的可行性和可重复性。

结果：在所有测试中（n = 18），伞均成功展开并定位良好。当通过胎儿镜端口应用时，伞成功地粘贴到了胎膜上，并且所有的伞都完全覆盖了缺损处（n = 5）。整个过程所需的平均时间为3分钟。

讨论：本研究是一个概念验证，为未来精确局部应用生物粘合剂预防iPPROM提供了一种潜在的解决方案。

一、引言

随着胎儿诊断和治疗技术的进步，在专业中心，胎儿镜检查已成为治疗孕期潜在危及生命疾病的一种切实可行的治疗选择。然而，这种对羊膜腔的侵入性干预伴随着胎膜早破的显著风险，进而导致早产，造成胎儿发病和死亡。早产主要是由于胎膜损伤，胎膜在手术损伤后不会自发愈合。医源性早产胎膜早破（iPPROM）的风险影响着全球大量孕妇，在所有胎儿镜检查病例中，其发生率高达30%。因此，人们普遍认为，对胎膜进行预防性密封和加固可以显著延长孕期，从而极大地改善胎儿的健康状况和存活率。

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与体外研究表明胎膜具有潜在愈合信号的报道相反，离体和体内研究显示，在胎膜愈合方面取得的成功非常有限，并且没有显示出任何降低胎膜破裂风险的证据。据报道，浓缩血小板与冷沉淀或工业用纤维蛋白胶结合，可能是一种有效的羊膜密封剂。然而，在一些报道的病例中，血小板注射的良好效果伴随着大量血小板生成，并引发了胎儿死亡。

最近，受贻贝启发而开发的能在潮湿环境中起作用的粘合剂，为有效封闭胎膜带来了新的希望。事实上，这种粘合剂在体外、离体以及兔子体内模型中都显示出了良好的密封潜力。

尽管有许多用于胎膜密封的候选粘合剂，但明显缺乏一种可靠的方法，来将这些液体密封材料准确地沉积在羊膜腔内胎膜缺损的确切部位。本研究旨在建立一种通过胎儿镜检查时使用的端口进入伤口来密封胎膜缺损的方法。为了实现这一目标，重点在于开发一种微创手术器械，能够以非常可控和局部的方式在胎膜穿刺部位输送粘合材料。

二、材料与方法

我们预防iPPROM的方法依赖于三个要素的组合：（a）一个用于收集粘合材料的伞状物；（b）一个用于引入伞状物的涂抹器；（c）一个用于在伞状物腔内输送粘合材料的注射系统。所有这些要素被组装在一个单一的器械中，使得密封过程能够通过五个简短的步骤完成。其思路是将伞状物通过胎儿镜端口插入，在羊膜腔内展开，将其拉回到子宫壁，并将伞状物粘贴到胎膜上。涂抹完粘合剂后将移除端口，而粘贴好的伞状物则留在原位，直至胎盘娩出。这种方法能够密封缺损，而无需使胎膜进一步从蜕膜上剥离，并且避免了为涂抹粘合剂而额外开孔的需要。

2.1. 用于胎膜预防性密封的器械组件

2.1.1. 收集密封材料的伞状物

聚酯织物涂层网被设计成伞状，负责在屏蔽环境下在穿刺部位收集粘合材料。它由两个部分组成：一个镍钛合金骨架和一个覆盖在骨架上的膜，用于将粘合剂固定在适当位置，并防止粘合剂流入羊水。镍钛合金是一种非常有弹性的、经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的金属合金，具有独特的形状记忆特性，使得伞状物在从导管中出来时能够自动展开成其原始形状。镍钛合金条的厚度设定为200微米，伞状的高度为3毫米。这些特性赋予了伞状物一定的机械阻力，以便外科医生在将其拉向胎膜使其变平甚至翻转之前能够感觉到阻力。伞的骨架由8根相同的椭圆形肋条组成，每根肋条都与相邻的肋条相连，形成一个圆形。这种圆形设计使得伞能够紧密折叠成一个比10法式端口小的形状（图1a，b）。它们是通过激光切割，然后进行基于温度的形状设定来生产的。

图1. 器械组件的照片。无（左）和有（右）Degrapol®膜覆盖的伞状受体的俯视图（a）和侧视图（b）。比例尺，5毫米。c处于打开状态的涂抹器器械原型。涂抹器负责将伞状物推入10法式导入器（未显示）内。粘合剂注射器是粘合剂的入口，在放置于涂抹器内的双腔管的辅助下，粘合剂被输送到伞状物中。比例尺，15毫米。伞状物的释放机制由一根穿过涂抹器（锁扣）的小金属线控制。当处于锁定位置时，这根金属线卡住连接到伞状物的缝合线。当处于解锁位置时，缝合线不再被卡住，伞状物就可以与涂抹器分离。

为了覆盖镍钛合金骨架，使用了Degrapol®（一种聚酯氨基甲酸酯聚合物织物），因为它具有高拉伸性和弹性。除了其理想的机械特性外，它之前已显示出良好的生物相容性，并且能够整合到兔子的胎膜中并促进再上皮化。为了制作这些织物，我们首先制作了150微米厚的Degrapol®薄片。为此，将600毫克冻干的Degrapol®溶解在3.52克氯仿和0.88克六氟异丙醇中，制成5克浓度为12%的Degrapol®混合物。将溶液在室温下放置过夜，然后将2毫升这种溶液以每小时1毫升的速度静电纺丝到12个在收集器上旋转的载玻片上。注射器针头与收集器之间的距离为10厘米。通过将其浸入30%的乙醇中，将得到的Degrapol®薄片从载玻片上取下。将镍钛合金网烧结在两片Degrapol®薄片之间，以获得稳定的复合材料。

东莞市富临塑胶有限公司是Degrapol在中国的代理商，富临塑胶为中国客户提供植入级可吸收聚氨酯Degrapol。

2.2. 涂抹器和注射器

设计并制造了一个外径为2.9毫米、内径为2.7毫米的不锈钢管。这个管子可以在10法式导管中自由滑动，并且足够紧密，可以将伞状物推过端口。一个连接到其粘合剂注射器的双腔管插入到空心管中，从近端到远端，以确保两种粘合剂基质仅在管子的远端合并到伞状物中。近端允许分别注射两种粘合剂前体。

伞状物必须保持与涂抹器相连，以防止其在展开时在羊膜腔中丢失，并能够将其拉向胎膜缺损处。为此，我们在伞的中心系上一根线，并将其连接到涂抹器远端的锁定系统上。当使用者解锁该系统时，线被松开，伞状物与涂抹器分离。

使用了一种基于氰基丙烯酸酯的、经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的单组分粘合剂，在潮湿环境中与存在的氢氧根离子接触时会聚合。在使用前，将该粘合剂直接从其安瓿转移到注射器管中。纤维蛋白胶和贻贝胶是在两种聚合物前体混合时容易聚合的密封剂。先前的研究表明，贻贝胶在潮湿条件下密封胎膜具有非常好的性能。如前所述，将聚合物基质溶解在2×磷酸盐缓冲液（PBS）中，并以1:1的体积比与12毫克/毫升的高碘酸钠混合，最终得到贻贝胶的浓度为150毫克/毫升。

2.3. 人胎膜

人胎膜是在获得患者书面同意后，根据伦理委员会的决定收集的。胎膜在足月剖腹产（37至39周之间）后采集，并在–80°C下冷冻保存，直至使用。所有胎膜的人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎、糖尿病、衣原体和B族链球菌检测均为阴性。

2.4. 力学测试优配网

2.4.1. 伞状物的机械稳定性

通过测量将伞状物（图1a）完全压平所需的力来评估其机械稳定性。在伞的凹面一侧的柄部系上一根线。然后拉动这根线，直到伞被压平，并用测力计测量所需的力。对有和没有Degrapol®织物的伞分别在坚硬表面（培养皿）和柔软表面（1.5厘米厚的牛肌肉）上进行拉动测试（n = 5）。

2.4.2 生物粘合剂将伞状物粘贴到完整胎膜上的粘附强度

将完整、干燥的胎膜平放在培养皿上，羊膜面朝上。将伞状物放置在胎膜上方，然后通过注射器向伞内注入500微升粘合剂，并让其聚合5分钟。使用测力计通过垂直于胎膜表面拉动伞状物来测量胎膜和伞之间由粘合剂提供的粘附强度（每种粘合剂测试n = 5次）。

2.5. 伞状物在穿刺胎膜上的应用和粘贴

2.5.1. 干燥实验条件

将胎膜安装在一个空塑料杯上，羊膜面向杯内。用直径6毫米的活检打孔器在一种粘性非常高的弹性膜上打孔，并将其放置在塑料杯模型上的胎膜上。为了量化机械稳定性，我们使用测力计测量将安装好的胎膜中心向上拉起1.5厘米所需的力。

2.5.2 完整的离体胎膜缺损模型

为了模拟手术干预，我们创建了一个生理相关的离体模型。选择含有一层总厚度为0.5厘米的小肌肉层的猪皮来模拟上腹壁。在“腹壁”下方添加一层1厘米厚的牛肌肉和一层人胎膜来模拟子宫层。将这两层与人类胎膜放在一起，拉伸后，放置在一个直径8厘米的铝制圆柱体上，并通过拧紧顶部的环以水密方式紧密夹紧（图2）。向圆柱体内加入生理盐水溶液以模拟羊水，并通过铝制圆柱体的侧端口排出剩余空气。用手术刀在模拟皮肤的材料上切一个5毫米的切口，以便于接触到下面的组织。为了量化机械稳定性，我们使用测力计测量将模型中心向上拉起1.5厘米所需的力。圆柱体上的两个入口可使圆柱体充满模拟羊水的溶液。另一个入口允许插入视频插管系统，以便对伞状物的放置进行视觉监控。测量手术过程中每个步骤所需的时间。

图2. 离体胎膜模型。夹在铝制圆柱体中的组织的侧视图（a）、俯视图（b）和仰视图（c）。比例尺，5厘米。

2.6. 缺损密封

将一个10法式端口安装在闭孔器上，并以45°角插入模拟组织中。取出闭孔器，将端口留在缺损处。将伞状物紧密折叠并插入端口，然后将其推入充满生理盐水溶液的腔体中。将伞状物拉向胎膜，然后使用连接到注射入口的注射器将500微升贻贝胶、纤维蛋白胶或一种基于氰基丙烯酸酯的、经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的单组分粘合剂（100微升对应双腔注射通道的死腔体积加上400微升粘合剂）通过注射器注入伞内。在伞状物保持伞状结构紧贴胎膜的同时，让粘合剂聚合1分钟。干预结束后，将胎膜从铝制圆柱体上取下并翻转过来。垂直于胎膜表面拉动伞状物，并用测力计测量将伞从胎膜上取下所需的力。

三、结果

3.1. 收集粘合剂的伞状物

为了评估伞的形状稳定性，我们比较了其镍钛合金骨架与由镍钛合金骨架和覆盖膜组成的完整伞的抗阻力。此外，我们在塑料培养皿或1.5厘米厚的肌肉层上进行了这项测试，目的是确定测量伞时所依托的支撑物的影响。虽然在坚硬和柔软表面上，骨架变形所需的力几乎相同，分别为0.21 ± 0.02牛和0.2 ± 0.02牛，但在柔软和坚硬的基底上，完整伞的抗变形能力都显著提高（图3）。在坚硬基底上压平所需的力（0.33 ± 0.02牛）明显高于柔软基底（0.25 ± 0.02牛）。这表明需要在软组织上对带膜的伞进行测试，以确保该测试对于其在体内应用的相关性。最后，结果显示涂抹器能够以极小的力（0.2 ± 0.02牛）穿过10法式导管并进入羊膜腔内部。

图3. 受体的形状稳定性。在牛肌肉（柔软表面）上、带有Degrapol®膜的伞状受体在拉力测试前（a）和拉力测试期间（b）的情况。比例尺，5毫米。c压平受体所需的力（n = 5；** p < 0.02）。

3.2. 伞状物与完整胎膜的粘附强度

第一步，我们评估了三种候选粘合剂将Degrapol®涂层伞粘贴到干燥、完整胎膜上的潜力，以选择最匹配的粘合剂用于进一步测试。测量得到的伞与胎膜之间的粘附力表明，贻贝胶达到了与基于氰基丙烯酸酯的单组分粘合剂相似的粘合性能（分别为0.83 ± 0.2牛和1.1 ± 0.17牛，n = 5），而纤维蛋白的粘附力仅为0.2 ± 0.14牛（n = 5），表现出非常弱的结合力（图4a，深灰色条）。基于氰基丙烯酸酯的单组分粘合剂的一个缺点是它会使胎膜和Degrapol®织物都变干，因此将其排除作为下一个实验的候选粘合剂。

图4. 伞状物与胎膜的粘贴情况。柱状图（a）显示了用贻贝胶（b；深灰色 n = 5；浅灰色 n = 5）、纤维蛋白胶（c；深灰色 n = 5；浅灰色 n = 5）或基于氰基丙烯酸酯的单组分粘合剂（d；深灰色 n = 5：浅灰色 n = 3）粘贴到胎膜上的伞状物的粘附强度。深灰色条代表受体直接粘贴在完整胎膜上的情况。这些照片展示了伞状物粘贴到完整胎膜上时的代表性图像。比例尺，5毫米。

3.3. 在干燥实验条件下受体在胎膜缺损上的应用和粘贴

接下来，我们在塑料杯模型的干燥实验条件下评估了我们方法的可靠性。我们使用我们的器械插入伞并输送粘合剂，将受体粘贴在胎膜缺损处。在所有测试中，受体在粘附和释放后都粘附在胎膜上。然而，所有粘合剂都显示出不同的粘附强度。基于氰基丙烯酸酯的单组分粘合剂能抵抗高达0.96 ± 0.38牛（n = 3）的拉力才会脱落，而贻贝胶和纤维蛋白的拉力分别为0.35 ± 0.12牛（n = 5）和0.17 ± 0.18牛（n = 5）（图4a，浅灰色条）。在所有情况（n = 13）下，伞都展开成其初始形状，紧密地放置在胎膜上，并且在注射时没有观察到粘合剂泄漏。此外，对模型机械稳定性的测量表明，位移1.5厘米所需的力为0.1牛。

3.4. 完整离体模型上的胎膜缺损密封过程

3.4.1 离体缺损密封

为了得出该方法可行性的结论，我们在一个更具临床相关性的模型上模拟了缺损密封，并使用内窥镜相机从腔体内部观察了手术过程（图5）。加入生理盐水溶液模拟羊水，多层结构改善了与解剖结构的相似性并提高了机械稳定性。事实上，评估机械稳定性的位移测试表明，位移1.5厘米需要1牛的力。选择贻贝胶是因为它适合在潮湿环境中使用且无细胞毒性。在所有试验（n = 5）中，伞都展开成其原始形状并正确地放置在缺损处。尽管观察到有一些轻微泄漏，但粘合剂在所有伞中都被很好地限制在内部。这些泄漏主要是由于Degrapol®的轻微渗透性以及注入的粘合剂体积过多造成的。然而，这从未影响伞与胎膜的粘附力。实际上，在释放和移除涂抹器后，所有伞都牢固地附着在胎膜上。将伞粘贴到胎膜上的平均粘附强度为0.13 ± 0.04牛。

图5. 离体胎膜缺损密封过程。a–e 从圆柱体内部展示的手术过程，重现了从羊膜腔观察的视角。a 在穿过模拟组织制造缺损后，导管（蓝色管子）刚刚进入的情况。白色的部件展示了紧密折叠状态的伞状物被引入（b）、展开（c）以及被拉向羊膜（d）的情形。e 贻贝胶被Degrapol®吸收，使其颜色变为红色。图中展示了拆解后粘贴在胎膜上的伞状物。比例尺，5毫米。

3.5. 手术时间

干预各部分所需的时间间隔总结在表1中。器械应用，包括将伞紧密折叠并放置在胎膜上，是手术过程中最长的步骤，平均为1分钟28 ± 43秒。在所有测试中，粘合剂注射时间都有一个固定的1分钟聚合期，此外还需要27 ± 7秒将注射器放置在粘合剂注射入口并注入粘合剂。最后，还需要13 ± 9秒来激活锁定系统并释放伞。总之，整个过程的总平均时间为3分钟8秒，这对于胎儿镜检查来说时间增加并不明显。

表1. 胎膜密封过程的统计数据

四、讨论

在这项研究中，我们开发了一种通过微创手术预防性密封胎膜缺损的新方法，并成功证明了其可行性。我们通过创建一个接近真实解剖条件的模型，并以可控的方式在胎膜穿刺部位输送粘合材料来证明这一点，我们认为这是有效密封胎膜的关键。事实上，先前那些展示水凝胶材料或血液凝固衍生材料沉积的研究，缺乏专门为解决这一问题而设计的可控方法。我们特意选择了多种密封材料——如纤维蛋白这样的双组分粘合剂、前景广阔的贻贝胶以及基于氰基丙烯酸酯的单组分粘合剂，目的是证明我们的器械与不同性质材料的兼容性，并突出我们的方法对于测试那些可注射候选材料的重要性。接下来，我们将更详细地讨论使这里介绍的器械成为在胎膜穿刺部位应用密封剂甚至愈合剂时值得认真考虑的选项的各个要素。

4.1. 伞状物

伞状物很容易折叠进端口，能自由地穿过端口，并且总是能自动展开成规定的形状。通过在坚硬或柔软表面进行的拉力测试所评估的机械稳定性表明，为了获得可转化为体内实际情况的相关数据，需要在覆盖有金属结构织物的情况下，并在柔软表面上测量镍钛合金骨架的稳定性。此外，相对较低的阻力（0.25牛）表明可能需要进行结构改变，以便将这个数值提高到可感知的阻力范围（0.5至1牛），但同时又不影响伞的折叠能力。这样做的原因是为了让外科医生在将伞应用到胎膜上时能够感觉到那个时刻。这可以通过增加镍钛合金的厚度和改变支柱的数量来实现。

至于覆盖镍钛合金骨架的织物，Degrapol®满足了收集粘合剂的期望，但其在进一步研究中的使用仅限于非氰基丙烯酸酯类粘合剂。使用替代方案来覆盖镍钛合金骨架有可能解决这一问题。例如，使用膨体聚四氟乙烯（ePTFE），这是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的聚合物，例如用于疝气修复，用它可以制成具有重要弹性和不渗透性的织物，符合我们应用的功能要求。这种聚合物也可以进行静电纺丝，并且在一些应用中已经用于覆盖镍钛合金支架。膨体聚四氟乙烯（ePTFE）与基于氰基丙烯酸酯的单组分粘合剂密封剂结合用于强化ePTFE移植物的临床应用也已经有过，这表明在未来的研究中可以考虑将这些材料结合使用。此外，基于氰基丙烯酸酯的单组分粘合剂和其他基于氰基丙烯酸酯的粘合剂在体内常用于眼睑皮肤移植且没有出现并发症。与ePTFE类似，硅树脂可以提供相同的机械性能。它与镍钛合金结合用于胸羊膜或膀胱羊膜分流器，使其成为我们应用的一个不错的候选材料。然而，需要进一步研究以确定与硅树脂结合的最佳粘合剂候选材料。

4.2. 伞状物与胎膜的粘附力

我们首先旨在评估不同粘合剂将伞状物与胎膜结合的固有能力，这是它们成功用于预防医源性早产胎膜早破（iPPROM）的必要条件。本研究中使用的粘合剂表现出不同的特性。纤维蛋白在任何测试中都没有效果，几乎无法测量到粘附力。贻贝胶和基于氰基丙烯酸酯的单组分粘合剂在粘贴到完整胎膜上时表现出非常好的性能，这证实了这些粘合剂作为胎膜密封剂的潜力。与先前的研究类似，基于氰基丙烯酸酯的单组分粘合剂在整个研究中表现出最强的粘结效率，但粘结强度与Degrapol®的溶解相关，这再次促使我们用更兼容的材料（如硅树脂或ePTFE）来替代它。

4.3. 离体模型上的手术模拟

最后，我们选择了先前已显示出在潮湿环境中具有显著作用潜力且对Degrapol®没有破坏作用的粘合剂。我们通过在圆柱体内重现羊膜腔的潮湿环境，并使用离体组织模拟腹壁和子宫壁，增加了试验的复杂性。这是必要的，因为与弹性体模型相比（1牛对比0.1牛），这使得整个组织模拟物提供的机械支撑增加了10倍，从而赋予了模型更高的生理相关性。

所有的伞都定位良好并成功收集了粘合剂。对附着力的测量表明，贻贝胶的粘附力相对较低（0.13 ± 0.04牛），但在释放伞后，所有的伞都仍然紧紧地附着在胎膜上。然而，数据显示在干燥条件下贻贝胶在完整胎膜上的粘附强度表明，贻贝胶有潜力实现较强的粘附力。不同的改进措施可能会影响粘附强度。例如，可以在涂抹器的远端添加一个混合器，以便更好地将粘合剂基质混合在一起。或者，优化粘合剂的体积和/或粘度可以通过改善羊膜和伞表面的流体动力学，显著有助于提高粘附强度。

下一步，需要在体内模型上测试该方法的可行性以及材料的正确使用。这对于评估（a）伞在真实条件下的适用性，以及（b）植入物在较长时间内的真实条件下的表现是必要的。此外，这样的实验将表明在分娩后，伞是否仍然附着在子宫壁上，以及是否需要通过刮宫将其移除。

4.4. 手术时间

此外，整个手术过程大约需要3分钟，当在手术步骤中增加一个步骤时，这是一个决定性因素。通过训练、积累经验，以及在手术开始时就让伞已经紧密折叠在管内，这个时间跨度可以进一步缩短，这使得时间因素对于采用该方法来说是一个可以忽略不计的因素。

五、结论

我们成功设计并制造了一种有效的器械，有助于在胎儿镜干预后以可控的方式沉积生物粘合剂，用于胎膜缺损的预防性密封。我们的数据表明，这种应用方法可以可靠地用于精确注射粘合材料，并从腔体内部密封穿刺的羊膜。这项研究还强调了需要为伞的织物寻找替代材料，以及需要更强效的粘合剂。我们相信，利用行业中已经存在的替代材料，这些要素可以在进一步的研究中得到改进。无论使用何种粘合剂，结果都证明了我们的方法在尊重胎儿镜干预器械所规定的几何要求的同时，成功放置用于收集生物粘合剂以封闭胎膜缺损的伞的可行性。因此，我们坚信这种方法在预防医源性早产胎膜早破方面具有前景，并为产前治疗开辟了新的视野。

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